植物(plant)組織培養(yǎng)滅菌及無菌操作控制技術(shù)(technology)
［目的要求］認識各類滅菌(Sterilization)劑，掌握其性質(zhì)、使用(use)方法；通過(tōng guò)在超凈工作臺上進行無菌操作訓(xùn)練，使學(xué)生初步掌握組織培養(yǎng)的無菌操作技術(shù)，養(yǎng)成無菌操作習(xí)慣。［知識模塊］滅菌技術(shù)、無菌操作技術(shù)［重點］植物組織培養(yǎng)各類設(shè)備及人員消毒的方法［難點］無菌操作規(guī)程［方法］采用一體化教學(xué)方法，教師借用多媒體進行簡要的講授后學(xué)生分組操作實踐。
一、植物組織培養(yǎng)滅菌1．濕熱滅菌（培養(yǎng)基）：在制備后的24h內(nèi)完成滅菌工序。⑴對高壓滅菌后不變質(zhì)的物品，可以延長滅菌時間或提高壓力。⑵對于一些布制品，洗凈晾干后用耐高壓塑料袋裝好，高壓滅菌20-30min。⑶高壓滅菌前后的培養(yǎng)基，其pH值下降0.2-0.3單位，要控制好滅菌的溫度和時間。⑷高壓滅菌通常會使培養(yǎng)基中的蔗糖水解為單糖，從而改變培養(yǎng)基的滲透壓。⑸培養(yǎng)基中的鐵在高壓滅菌時會催化蔗糖水解，高壓下蔗糖水解大大增強，添加1%活性炭，蔗糖水解率可達5%。 注意事項：防止高壓滅菌培養(yǎng)基變化的方法
(1)經(jīng)常注意搜集有關(guān)高壓滅菌影響培養(yǎng)基成分的資料，及時采取有效措施。壓力蒸汽滅菌器具有造型新穎美觀、結(jié)構(gòu)合理、功能齊全、加熱迅速、滅菌*等優(yōu)點。適用于醫(yī)療、科研、食品、等單位對手術(shù)器械、敷料、玻璃器皿、橡膠制品、食品、藥液、培養(yǎng)基等物品進行滅菌。
(2)設(shè)計(design)培養(yǎng)基配方時盡量采用效果類似的穩(wěn)定試劑(Reagent)并準(zhǔn)確掌握劑量。如避免使用果糖和而用，以IBA代替IAA，控制活性炭的用量(在0.1%以下)注意pH值對高壓滅菌下培養(yǎng)基中成分的影響等。
(3)配制培養(yǎng)基時應(yīng)注意成分的適當(dāng)分組與加入(jiā rù)的順序。如將磷(P)、鈣和鐵放在**后加入。
(4)注意高壓滅菌(Sterilization)后培養(yǎng)基pH值的變化及回復(fù)動態(tài)。壓力蒸汽滅菌器具有造型新穎美觀、結(jié)構(gòu)合理、功能齊全、加熱迅速、滅菌*等優(yōu)點。適用于醫(yī)療、科研、食品、等單位對手術(shù)器械、敷料、玻璃器皿、橡膠制品、食品、藥液、培養(yǎng)基等物品進行滅菌。如高壓滅菌后的pH值常由5.80升高**6.48。而96h后又回降**5.8左右。這樣在實驗（experiment)中就可以根據(jù)這一規(guī)律加以掌握。 2.過濾滅菌（不耐熱的物質(zhì) ）如一些抗生素類物3.紫外線和熏蒸滅菌（空間）
(1)紫外線滅菌：在接種室、超凈臺上或接種箱里用紫外燈滅菌。紫外線的波長為200—300nm，其中以260nm的殺菌能力**強，但是由于紫外線的穿透物質(zhì)的能力很弱，所以只適于空氣和物體表面的滅菌，而且要求距照射物以不超過1.2m為宜。在接種前打開紫外燈進間(room)及超凈臺滅菌30min，然后進行接種。
(2)熏蒸滅菌：用加熱焚燒、氧化等方法(method)，使化學(xué)(huà xué)藥劑變?yōu)闅怏w狀態(tài)擴散到空氣中，以殺死空氣和物體表面(appearance)的微生物。這種方法簡便，只需要把消毒的空間關(guān)閉緊密即可。常用熏蒸劑是甲醛，熏蒸時，房間關(guān)閉緊密，按5—8ml／m3用量，將甲醛置于廣口容器中，加5g/m3高錳(manganese)酸鉀氧化揮發(fā)。熏蒸時，房間可預(yù)先噴濕以加強效果。冰醋酸也可進行加熱熏蒸，但效果不如甲醛。4.噴霧滅菌（物體表面）物體表面可用一些藥劑涂擦、噴霧滅菌。如桌面、墻面、雙手、植物材料表面等，可用70%的酒精反復(fù)涂擦滅菌，l%-2%的來蘇兒溶液以及0.25%—1%的新潔爾滅也可以。5.植物材料表面用消毒劑滅菌（外植體）從外界或室內(nèi)選取的植物材料，都不同程度地帶有各種微生物。這些污染源一旦帶人培養(yǎng)基，便會造成培養(yǎng)基污染。因此，植物材料必須(have to)經(jīng)嚴(yán)格的表面滅菌處理，再經(jīng)無菌操作手續(xù)接到培養(yǎng)基上，這一過程叫做接種。**步，將采來的植物材料除去不用的部分，將需要的部分仔細洗干凈，置自來水龍頭下流水沖洗幾分鐘**數(shù)小時，沖洗時間視材料清潔(clean)程度而宜。洗時可加入洗衣粉清洗，然后再用自來水沖凈洗衣粉水。洗衣粉可除去輕度附著在植物表面的污物，除去脂質(zhì)性的物質(zhì)，便于滅菌液的直接接觸(contact)。當(dāng)然，**理想的清洗物質(zhì)是表面活性物質(zhì)—吐溫。第二步對材料的表面浸潤滅菌。要在超凈臺或接種箱內(nèi)完成，準(zhǔn)備好消毒的燒杯、玻璃棒、70%酒精、消毒液、無菌水、手表等。用70%酒精浸10～30s。由于酒精具有使植物材料表面被浸濕的作用，加之70%酒精穿透力強，也很易殺傷植物細胞，所以浸潤時間不能過長。第三步用滅菌劑處理。表面滅菌劑的種類較多，可根據(jù)情況選取1—2種使用(use)見表。常用滅菌劑使用濃度及效果比較表
滅菌劑 使用濃度(%) 持續(xù)時間（min） 去除的難易 效果 次氯酸鈣 9～10 5～30 易 很好 次氯酸鈉 2 5～30 易 很好 0.1～1 5～8 較難 **好 抗菌(anti-microbial)素 4～50mg/L 30～60 中 較好
上述滅菌(Sterilization)劑應(yīng)在使用前臨時配制，滅菌后用無菌水涮洗3—4次即可；用液滅菌的材料，難以對殘毒較難篩除，所以應(yīng)當(dāng)用無菌水涮洗8～10次，每次不少于3min，以盡量去除殘毒。滅菌時，把瀝干的植物材料轉(zhuǎn)放到燒杯或其他器皿中，記好時間，倒人消毒溶液，不時用玻璃棒輕輕攪動，以促進材料各部分與消毒溶液充分接觸，驅(qū)除氣泡，使消毒*。滅菌時間是從倒人消毒液開始，**倒入無菌水時為止。吐溫的用量和滅菌時間，一般加入滅菌液的O.5%，即在100ml加入15滴。**后一步是用無菌水涮洗，涮洗要每次3min左右，視采用的消毒液種類，涮洗3-l0次左右。無菌水涮洗作用是免除消毒劑殺傷植物細胞的副作用。
二、無菌操作技術(shù)
一、用品超凈工作臺、75％的酒精、95％的酒精、盛有培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶、接種器械（主要指、剪刀、鑷子等）、酒精燈、培養(yǎng)材料（根、莖、葉或種子等）、0．1％的（或漂白粉）、無菌（fungus)水等。生物安全柜是為操作原代培養(yǎng)物、菌毒株以及診斷性標(biāo)本等具有感染性的實驗材料時，用來保護操作者本人、實驗室環(huán)境以及實驗材料，使其避免暴露于上述操作過程中可能產(chǎn)生的感染性氣溶膠和濺出物而設(shè)計的。
二、方法步驟（一）在接種前4h用甲醛與混合薰蒸接種室，并打開紫外燈照射30min；（二）正式接種前半小時左右，打開超凈工作臺上的紫外燈和風(fēng)機，20～30min后接種；
（三）用肥皂水洗凈雙手，在緩沖間內(nèi)穿好滅過菌的實驗（experiment)服、帽子與拖鞋，進入接種室；（四）用75％的酒精擦拭工作(gōng zuò)臺面和雙手；（五）用蘸（zhàn)有75％酒精的紗布擦拭裝有培養(yǎng)基的培養(yǎng)器皿，放進工作臺；
（六）把、剪刀、鑷子等器械浸泡在95％酒精中，在火焰上滅菌后，放在器械架上；
（七）把植物材料放進75％的酒精中浸泡約30s，再在0．1％的中浸泡5～10min，或在10％的漂白粉(化學(xué)式Ca(ClO)?)上溶液中浸泡10～15min，浸泡時可進行攪動，使植物材料與滅菌劑有良好的接觸；然后用無菌水沖洗3～5次；
（八）用火焰燒瓶口，轉(zhuǎn)動瓶口使瓶口各部分都燒到，打開封口塑料；
（九）取下接種器械，在火焰上滅菌；
（十）把培養(yǎng)材料(Material)迅速放入培養(yǎng)瓶，扎上瓶口（每人接種5～10瓶）。操作期間應(yīng)經(jīng)常用75％酒精擦拭工作臺和雙手；接種器械應(yīng)反復(fù)在95％的酒精中浸泡和在火焰上滅菌；
（十一）接種結(jié)束后，清理和關(guān)閉超凈工作臺。
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